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鄭金松研究副技師（分子生物研究所／國家型干擾性核醣核酸核心實驗室負責人）中央研究院週報 第1179期
許多科學上重大的突破來自於意外的發現；例如，佛萊明（Alexander Fleming, 1928）觀察到真菌的侵入能減弱菌斑的形成，而這項意外的發現，讓佛萊明找到世上第一個抗生素。核醣核酸干擾（RNAi interference；RNAi）是一種轉錄後基因沉默化（post-transcriptional gene silencing, PTGS）的現象，可模擬基因功能喪失的效果。此現象也是科學研究上意外的發現，這中間含括數起饒富趣味和令人驚奇的事件。從RNAi 的發現到在哺乳類動物上的應用，是一段迷人的過程，而其中顯現出意外發現需要有能解開謎題的天賦，也證實了機會偏愛降臨到有決心與毅力的人身上。
喬治森（Jorgensen）的團隊（Napoli et al., 1990）在1990 年，原欲藉由引入CHS（chalcone 合成酶）基因於矮牽牛花花瓣上，以使花色改造成深紫色；然而出乎意料地，他們發現在有轉殖CHS 基因的植物中，約42%的牽牛花開出全白或紫白相雜的花朵，而實驗控制組的植物並未產生這樣的變化。有趣的是，染色體組DNA 的研究顯示，紫色的程度和由內生或外源引入CHS 基因的穩定態訊息RNA（message RNA；mRNA）量有關，亦即在白花中，內生和外源引入的CHS 基因表現皆被抑制。當時，造成同源基因共同被抑制的機制尚不清楚，然而在改變花色的植物中，可很明顯觀察mRNA 含量的減少，因而有了一個用來闡述這現象的術語--轉錄後基因沉默化。羅曼諾（Ramano）等人也在1992 年提出「壓制」現象，他們發現在粉色麵包黴菌（Neurospora crassa）裡，藉由轉殖同源序列DNA 可暫時抑制基因的表現，這和CHS 轉殖植物的研究結果雷同。此後數年，無人再重視這項發現，大家只視這些為怪異或例外的現象。
約同一時期，反義股RNA（antisense RNA）技術在線蟲（Caenorhabditis elegans）系統中被發展來研究基因的功能，經由這項技術，反義股RNA 能造成線蟲中的基因被有效且專一地抑制。有一組科學家（Guo et al., 1995）利用注射par-1 反義股RNA 至野生型線蟲的生殖腺，首度證明生殖細胞的發育和建造胚胎的極性需要PAR-1。然而，用試管合成的正股RNA（sense RNA）處理生殖腺產生更有效的效果；這現象迷惑了線蟲陣營的科學家數年之久。至1998 年，於數種多細胞的有機生物，例如植物、真菌、線蟲等，皆發現了PTGS 的現象。於此年科學家提出，PTGS 是藉由胞內流程，利用雙股RNA 引發的基因沉默，這項重大的科學成就因而獲頒諾貝爾獎，也再次證明，諾貝爾獎總是眷顧有恆心與有好奇心並能針對問題窮追不捨的人。
在1998 年，Fire 和Mello（Fire et al., 1998）首先嘗試去釐清PTGS 這個令人疑惑的問題。他們質疑（1）為何正股和反義股RNA 各自可足以使基因失活或干擾基因功能；（2）為何干擾的效果可代代相傳，甚至，當引入正股和反義股RNA 至線蟲的胚胎時，RNA 可迅速地被降解。他們大膽假設，用來進行干擾試驗的噬菌體RNA 聚合酶的RNA 產物或次產物，可能參雜具有雙股特性的RNA 分子。為了評估雙股RNA 在PTGS 中扮演的潛在角色，他們用unc-22 基因作為研究此可能性的基因模式。他們的發現如下（摘錄自《自然》期刊391: 806-811,1998）：“在特定生物系統中，經由實驗引入RNA 到細胞內，可以干擾內生性基因的功能，像這樣的效果，已被提出是源自於一簡單的反義股RNA 機制，而此機制是和外加RNA 與內生訊息RNA 間的雜交（hybridization）有關。此技術已成功應用於研究線蟲基因的調控。於此研究中，我們研究干擾性RNA 結構所需要的條件與傳送的方法；出人意料地，我們發現雙股RNA 比用任一單股RNA 產生更有效的干擾效果；在注射到成熟動物後，純化的單股RNA 至多產生一些效果，而雙股RNA 則具有較大潛力引發專一性的抑制。在注射的動物和他們的後代，這樣的干擾現象是相當顯著的；只需注射小量的雙股RNA 即可影響細胞，這和化學劑量的概念相違，因而暗示在干擾過程中可能會涉及催化或放大效應。”
File 和Mello 的傑出研究說明了，PTGS 是由雙股RNA 所引發，因此他們創造了「核醣核酸干擾現象」（RNA interference, RNAi）術語來描述這個嶄新的細胞現象。此外，他們猜測在細胞內有一放大的步驟使得核醣核酸干擾具持久性。以RNA 為模板的RNA 聚合酶（RdRP）是一種可以利用小片段RNA（siRNA）反義股當引子去製造更多雙股RNA的酵素。後來的確在植物、真菌與線蟲（Catalanotto et al., 2000; Dalmay et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Sijen et al., 2001）中，發現RdRP 可放大核醣核酸干擾現象而造成干擾現象的持續性。在植物中，此放大反應使得由RNAi 所調控的基因抑制現象可經由細胞間雙股RNA 的傳遞來擴散，以全面對抗病毒感染。其後，科學家發現雙股RNA 抑制基因表現具有序列專一性，而此是由一短片段RNA 分子所調控，如今知曉此分子為“短干擾性RNA”（short interfering RNA；siRNA）。在植物中此種分子的長度約為25 個核苷酸（Hamilton et al., 1999）；在動物約為21 至23 個核苷酸（Hammond et al., 2000）；這些造成基因沉默的siRNA 序列與一部份訊息RNA 相對應。
RNAi 被廣泛認為是遠古自然的細胞防禦機制，在植物或昆蟲，可用此來對抗由病原菌產生的雙股RNA 中間產物或次產物。然而，在哺乳類系統，長度超過30 個鹼基的雙股RNA 會直接作用於細胞內的RNA 結合蛋白，擊發訊息傳導，啟動第一型干擾素反應及活化非專一性的核醣核酸（RNase）。接著，第一型干擾素誘發數個干擾素激化基因的表現，在細胞中引起非專一性、廣泛性的基因沉默，進而造成哺乳類細胞的凋亡；在哺乳類細胞，干擾素反應使得以長雙股RNA 抑制基因表現的應用受阻。涂須爾（Tuschl）的研究團隊借助前人的研究成果，發現直接用化學合成有著3 端突出的21 個核苷酸雙股siRNA，在多種哺乳類細胞株內能特別抑制內生性和外源性基因表（Elbashir et al., 2001）。因此，含21 個核苷酸的雙股siRNA 成為解析哺乳動物基因功能的新利器。利用細胞的RNAi機制去降低基因產物大大加速了基因功能的了解。RNAi 在生物過程中的重要性和廣泛的應用性，始得「科學」（Science）期刊宣稱“RNAi 是2002 年的重大突破＂。
後續生化學的研究結果顯示，RNAi 是利用一個錯綜複雜的蛋白質群組去引發標的訊息RNA 降解，以導致基因功能的喪失。詳細的歷史和RNAi 的機制可以參閱近期《當代頂尖微生物免疫》（Curr Top Microbiol Immunol 2008,volume 320:1-201）期刊的回顧文章。
雖然帶有3 端突出的21 個核苷酸，可用序列專一性來調節RNAi 於培養的哺乳類細胞，但合成的siRNA 試劑庫價格高昂且須藉由轉染傳送到細胞，已知並非所有細胞都有著好的轉染效率，且在活體更為困難；此外，由於缺乏放大RNAi 的步驟，siRNA 在哺乳類僅能產生短暫的效果；這些限制了合成siRNA 的應用性。
於此時，RNAi 領域正蓬勃發展。在研究RNAi 分子機制的過程中，科學家發現，在細胞質中，siRNA 和miRNA是藉由一個類似RNase III 的核酸酵素—Dicer 所處理（processing）而形成。Dicer 會將雙股RNA 前驅物變成21 至23 個核苷酸的siRNA 或miRNA；亦即，這兩種微小RNA 於細胞質中共用相同的RNA 處理器。生化和遺傳研究顯示，沉默或突變Dicer，會導致一種大小約70 個核苷酸具短夾型構造的RNA（short hairpin RNA；shRNA）堆積於哺乳類和低等的真核細胞中，暗示此shRNA 為miRNA 的前驅物。科學家基於此些發現而發展利用RNA 聚合酶III的驅動子表現shRNA，於細胞內再利用Dicer 將shRNA 剪接成siRNA。由於RNA 聚合酶III 轉錄的起始位置已被清楚鑑定，且知當聚合酶遇到連續4-5 個胸腺嘧啶核苷酸（T），轉錄會停止並終結於第二個尿嘧啶核苷酸（U）（在DNA 為T）；因此，此shRNA 結構具明確的5’ 端和3’ 端。
在RNAi 技術成熟之前，哺乳類系統中並沒有一套可進行全基因方位的遺傳篩選工具。由於生技公司或學界致力於RNAi 的應用研究，迄今市面上已有全基因方位的siRNA 或shRNA 試劑庫。這些RNAi 試劑可於哺乳動物系統中進行專一性地抑制單一基因表現；因此，此全基因方位的RNAi 試劑庫可應用於功能基因體學研究及新藥開發。
參考文獻：
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11. Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T. (2001) Duplexes of 21-nucleotide
RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-498.
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